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利用CRISPR金纳米颗粒在体内诱导同源介导的DNA修复 – 微米纳米网
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利用CRISPR金纳米颗粒在体内诱导同源介导的DNA修复

杜氏肌营养不良是是一种由抗肌营养不良蛋白缺乏引起的肌肉退化性疾病。在大约三分之一的患者中,编码抗肌营养不良蛋白的基因发生小片段缺失或者单碱基突变,从而使得它丧失功能,这就让这种基因成为基因编辑的一种极佳的候选对象。科学家们之前已利用病毒运送CRISPR-Cas9组分来剔除这个基因中发生突变的外显子,并且让这种疾病的模式小鼠获得临床上的症状改善。

但利用病毒递送CRISPR编辑组件存在安全隐患——脱靶效应。

2017年10月2日在线发表在《Nature biomedical engineering》期刊上的一项研究——《Nanoparticle delivery of Cas9 ribonucleoprotein and donor DNA in vivo induces homology-directed DNA repair》开发了一种被称为CRISPR-Gold的载体(一种非病毒递送载体)。完成该研究的科学家认为,该载体可以将Cas9核酸内切酶和供体DNA递送到多种类型的细胞中,有效地校正引起小鼠杜氏肌营养不良的DNA突变,并将其脱靶DNA损伤率降至最低。

研究背景

以CRISPR-Cas9为基础的治疗,尤其是那些可以通过同源定向修复来纠正基因突变的治疗,有可能彻底改变遗传疾病的治疗。但是CRISPR-Cas9基因编辑的应用迄今为止因遭受运送挑战(也就是如何把所有的CRISPR组分提供给每个需要它们的细胞中)而受到限制。

利用病毒来转运CRISPR技术的编辑组件,存在一定的风险(脱靶效应),而且会降低CRISPR组件的编辑效率。如何使脱靶效应降低,提高安全性,是科学家们最关注的问题之一。

实验思路

1、设计和合成CRISPR-Gold:对DNA进行修饰使其能够粘附到金纳米颗粒上,这种偶联着金纳米颗粒的DNA结合到进行HDR修复所需的供者DNA上,随后Cas9蛋白和gRNA依次结合上来。

2、(1)在表达蓝色荧光蛋白(BFP)的HEK293细胞上进行HDR实验,以研究CRISPR-Gold在细胞中诱导HDR的能力。通过流式细胞术测定BFP-HEK细胞经历的HDR水平。(2)将含有Alexa647标记的sgRNA的CRISPR-Gold添加至HEK293细胞,并使用流式细胞术测量摄取效率。使用各种抑制剂和低温处理来研究细胞摄取CRISPR-Gold机制。(3)在人胚胎干细胞、人诱导的多能干细胞中研究CRISPR-Gold的递送效率。合成用于编辑CXCR4基因或肌营养不良蛋白基因的CRISPR-Gold,并分析它们在细胞培养中进行基因编辑的能力。

3、将CRISPR-Gold注射到不产生抗肌营养不良蛋白的杜兴氏肌肉营养不良模式小鼠中来测试CRISPR-Gold在体内发生HDR修复的效率。

4、在Ai9小鼠(Ai9 DNA序列中的基因缺失导致tdTomato荧光蛋白的表达)体内确定CRISPR-Gold是否可以递送Cas9 RNP并产生双链断裂。

5、CRISPR-Gold与CTX同时注射到8周龄mdx小鼠的后腿肌肉中。两周后,将小鼠处死,通过免疫荧光分析肌养蛋白的表达,通过深度测序分析HDR以及纤维化程度。

6、将CRISPR-Gold以6mg / kg的Cas9蛋白质注射到mdx小鼠的腓肠肌中。在CRISPR-Gold注射后24小时和两周分析系统性细胞因子概况,分析CRISPR-Gold的免疫原性。

实验结果

1、CRISPR-Gold合成方法。CRISPR-Gold对Cas9 RNP的复合效率为61.5%,具有开发Cas9递送载体所需的络合效率。

利用CRISPR金纳米颗粒在体内诱导同源介导的DNA修复

2、多种方法证明CRISPR-Gold可在体外诱导HDR。

利用CRISPR金纳米颗粒在体内诱导同源介导的DNA修复

3、CRISPR-gold诱导HDR并促进原代成肌细胞中肌养蛋白的表达。

利用CRISPR金纳米颗粒在体内诱导同源介导的DNA修复

4、CRISPR-Gold可以高效地在体内递送Cas9 RNP并编辑基因组DNA。

利用CRISPR金纳米颗粒在体内诱导同源介导的DNA修复

5、CRISPR-Gold通过CTX刺激促进肌营养不良蛋白基因和肌营养不良蛋白表达中的HDR,并降低mdx小鼠的肌肉纤维化。

利用CRISPR金纳米颗粒在体内诱导同源介导的DNA修复

6、与没用CTX处理的小鼠相比CRISPR-Gold显著增强了肌肉强度。CRISPR-Gold不会引起血浆中炎性细胞因子的上调或多次注射后的体重减轻,这表明CRISPR-Gold没有广泛的免疫应答并且可以安全使用多次。

利用CRISPR金纳米颗粒在体内诱导同源介导的DNA修复

研究意义

CRISPR-Gold是CRISPR在生物医学应用中取得的一次重大进步,因为它可以在体外和体内递送Cas9蛋白,gRNA和供体DNA,并通过HDR编辑基因。CRISPR-Gold为治疗由点突变和小片段缺失引起的DMD提供了新的治疗策略。对于这类患者,CRISPR-Gold有可能将其突变校正回野生型序列,并在不使用病毒的情况下再生全功能野生型肌营养不良蛋白。非病毒运载工具可以在体内产生HDR,具有治疗遗传性疾病的巨大潜力。

原文摘要

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)–CRISPR associated protein 9 (Cas9)-based therapeutics, especially those that can correct gene mutations via homology-directed repair, have the potential to revolutionize the treatment of genetic diseases. However, it is challenging to develop homology-directed repair-based therapeutics because they require the simultaneous in vivo delivery of Cas9 protein, guide RNA and donor DNA. Here, we demonstrate that a delivery vehicle composed of gold nanoparticles conjugated to DNA and complexed with cationic endosomal disruptive polymers can deliver Cas9 ribonucleoprotein and donor DNA into a wide variety of cell types and efficiently correct the DNA mutation that causes Duchenne muscular dystrophy in mice via local injection, with minimal off-target DNA damage.

Lee K, Conboy M, Park H M, et al. Nanoparticle delivery of Cas9 ribonucleoprotein and donor DNA in vivo induces homology-directed DNA repair[J]. 2017.


杭州观梓健康科技有限公司专注于基因编辑技术及诱导多能干细胞研发,面向用户提供专业、高效的科研解决方案。

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